Základy farmakogenomiky

Metodiky stanovení genových polymorfismů

1. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)
2. Polymerázová řetězová reakce
3. PCR-REA
4. Další varianty PCR
5. Real-time PCR
6. Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP)
7. Sekvencování
8. DNA čipy

---

5. Amplifikace DNA v reálném čase, tzv. "real-time PCR"

(prezentace: .ppt (585,5 kB), .odp (457,0 kB))


5.1. Základní koncept

Další rozvoj technologie polymerázové řetězové reakce vyústil ve vývoj techniky, která umožňuje současné provádění amplifikace DNA a detekce výsledných amplikonů v jedné zkumavce pomocí světelného signálu z fluoroforů. Fluorofory jsou obecně jakékoli molekuly, které jsou v excitovaném stavu schopny emitovat fluorescenci (Obr. 5.1). Většina fluoroforů jsou heterocyklické nebo polyaromatické uhlovodíky (Obr. 5.2.). Fluorofory se buď navazují přímo na vznikající amplikony nebo jsou jimi značeny tzv. "hybridizační sondy". Hybridizační sondy jsou krátké sekvence nukleotidů, fluorofory jsou značeny nukleotidy na 5´- nebo 3´- koncích sond.

Díky fluoroforům je, na rozdíl od konvenční PCR, možné dynamicky posuzovat aktuální průběh syntézy amplikonu, aniž by došlo k zásahu do vlastního procesu amplifikace. Skutečnost, že můžeme sledovat nabývání amplikonů v každém cyklu vedla k označení této techniky jako "amplifikace v reálném čase" ("real-time" PCR) nebo též "amplifikace DNA v reálném čase". Analogicky pro amplifikaci RNA (ve které je v prvním kroku zařazena zpětná transkripce) platí termín "real-time RT-PCR". Za ekvivalentní se považují termíny "kinetická PCR" nebo "homogenní PCR".

Monitorování akumulace amplikonu v reálném čase uděluje metodě PCR další významný analytický parametr, který dovoluje kvantifikaci matrice nukleové kyseliny na počátku procesu vložené do reakce, tedy původně izolované z buněk, orgánů, tkání nebo tělních tekutin. Tím se PCR v reálném čase odlišuje od konvenční PCR, která v běžném provedení pouze kvalitativně vyhodnocuje přítomnost nebo absenci výsledného PCR produktu v obarvených elektroforetických gelech.

Obr. 5.1. K fluorescenci dochází po absorpci světelné energie fluoroforem při jedné vlnové délce a následné emisi světla v jiné, delší vlnové délce s nižší energií.



Pro zobrazení další části se musíte přihlásit

doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.