Základy farmakogenomiky

Metodiky stanovení genových polymorfismů

1. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)
2. Polymerázová řetězová reakce
3. PCR-REA
4. Další varianty PCR
5. Real-time PCR
6. Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP)
7. Sekvencování
8. DNA čipy

---

4. Další varianty PCR

(prezentace: .ppt (1,6 MB), .odp (919,5 kB))


Alelově specifická PCR (ASA - allele specific amplification, PASA - PCR amplification of specific alleles, ASP - allele-specific PCR, ARMS - amplification refractory mutation system) vychází ze skutečnosti, že specifický a efektivní annealing je z podstatné části determinován posledními dvěma nukleotidy na 3´- konci primeru. Při této aplikaci je tedy sledovaná alela amplifikována s vysokou účinností, kdežto jiné alely, které mají v místě, kam se 3´- konec primeru připojuje, bodovou mutaci, amplifikují s účinností nízkou. Jeden ze dvou primerů je při této reakci specifický pro obě alely, druhý primer je diskriminační. Existují i varianty, při kterých je polymorfismus detekován primerem, který má nukleotidovou záměnu nikoli na 3´-konci, ale uprostřed (competitive oligonucleotide primer (COP) assay).

Multiplex PCR umožňuje amplifikaci více lokusů v jedné PCR reakci. Na každý lokus jsou navrženy dva primery jako v klasické PCR, ale všechny primery musí mít teoreticky stejnou teplotu annealingu. Velikost amplifikačních produktů z jednotlivých lokusů pak musí být snadno odlišitelná v elektroforéze. Metoda je náročná ve fázi vývoje a evaluace, protože vyžaduje detailní a promyšlený návrh primerů a následné sestavování postupným přidáváním jednotlivých dvojic k už existující a ověřené struktuře. Existují však systémy, které dokáží amplifikovat až 12 lokusů současně.

Kompetitivní PCR je základním principem kvantitativní PCR. Může být založena dvojím způsobem:
1) Při jednom uspořádání jsou použity stejné primery na dvě matrice poskytující různě dlouhé produkty amplifikace. V tomto případě dochází mezi dvěma matricemi ke kompetici o primery.
2) Při druhém uspořádání jsou použity různé primery pro cílovou sekvenci a sekvenci kompetující. Ke kompetici dochází na úrovni substrátu a enzymu.


Pro zobrazení další části se musíte přihlásit

doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.