Základy farmakogenomiky

Metodiky stanovení genových polymorfismů

1. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)
2. Polymerázová řetězová reakce
3. PCR-REA
4. Další varianty PCR
5. Real-time PCR
6. Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP)
7. Sekvencování
8. DNA čipy

---

3. PCR-REA

Základní PCR reakce obsahuje dva primery a slouží k detekci jednoho specifického lokusu ve formě amplikonu o předem vypočtené velikosti. Pro účely vyhledávání jednoduchých nukleotidových polymorfismů je možné amplifikační produkty dále štěpit restrikční endonukleázou a toto uspořádání se pak označuje jako PCR-REA (PCR-restriction enzyme analysis), PRA (primer restriction analysis) nebo PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism).

Touto metodou je možné analyzovat jakýkoli gen a to až do délky přibližně 5 kbp. Výsledkem amplifikace jsou v tomto případě produkty o stejné délce, které je možno detekovat elektroforeticky. Amplikony jsou poté štěpeny vhodnou restrikční endonukleázou a výsledné produkty opět analyzovány gelovou elektroforézou.

Metoda PCR-REA poskytuje velmi jednoduchou, rychlou a vysoce citlivou strategii detekce jednoduchých genových polymorfismů. Na druhé straně lze restrikční štěpení použít k vyhledávání genových polymorfismů jen v případě, že se v daném lokusu dvě alely liší takovým způsobem, že jedna z nich restrikční místo obsahuje, jiná nikoli.

Příklad analýzy genového polymorfismu K469E v genu ICAM1 (.pdf (111,2 kB))

V genu ICAM-1 bylo identifikováno nejméně dvacet jednoduchých nukleotidových polymorfismů. Dva z nich jsou spojovány s Crohnovou chorobu. Polymorfismus v kodonu 241 (G/R241, Gly/Arg, exon 4) a kodonu 469 (K/E469, Lys/Glu, exon 6). Polymorfismy způsobují změny v řetězcích aminokyselin na imunoglobulinových doménách proteinu ICAM-1, což způsobuje alterace jejich interakce se specifickými ligandy.

Polymorfismus K469E je nekonzervativní substitucí aminokyselin na páté imunoglobulinové doméně ICAM-1. Tato doména je důležitá pro adhezi a B-buněk a dendritických buněk, je prezentována jako imunodominantní epitop molekuly ICAM-1.



Pro zobrazení další části se musíte přihlásit

doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.