Základy farmakogenomiky

Metodiky stanovení genových polymorfismů

1. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)
2. Polymerázová řetězová reakce
3. PCR-REA
4. Další varianty PCR
5. Real-time PCR
6. Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP)
7. Sekvencování
8. DNA čipy

---

2. Polymerázová řetězová reakce

(prezentace: .ppt (3,4 MB), .odp (3,1 MB))


2.1. Úvod

Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction, PCR) je dnes základní technikou molekulární diagnostiky a manipulace s geny vůbec. Jak tvrdí objevitel polymerázové řetězové reakce, Kary Mullis, napadla ho základní idea metody, která je dnes základní technikou molekulární diagnostiky a manipulace s geny, v roce 1985. Projížděl prý tenkrát, jako každý pátek, noční tmou alejemi kvetoucích kaštanů a přemýšlel o nových metodách sekvencování DNA. Namísto toho ho napadlo, jak zdvojit počet specifických úseků DNA a jak toto zdvojení opakovat, v principu nekonečněkrát. Myslel na dva oligonukleotidy, orientované proti sobě a na DNA polymerázu a jak by tak zvýšil počet cílů na DNA. Každý produkt by se pak stal cílem pro další reakci, což by vedlo k zefektivnění výtěžku produktu, kterého by v každém cyklu vznikalo dvojnásobné množství. Podobně jako v řetězové reakci vedoucí k jadernému štěpení, kdy každý reaktant na počátku (neutron nebo molekula DNA) vytvářejí dva podobné produkty, z nichž každý slouží zase jako spouštěč další reakce. Objev tohoto exponenciálně rostoucího amplifikačního systému se stal rychle známý jako polymerázová řetězová reakce.

2.2. Základní popis PCR

Polymerázová řetězová reakce umožňuje selektivní zmnožení (amplifikaci) určité oblasti DNA v podmínkách in vitro; a to procesem, který připomíná replikaci DNA in vivo (Obr. 2.1).

Obr. 2.1. Syntéza řetězce DNA začíná na volném 3´-OH konci primeru. Nově syntetizované vlákno se tvoří podle matrice na základě komplemetarity bazí. Vysvětlivky u obr. 2.



K amplifikaci je zapotřebí jeden řetězec DNA (tzv. DNA-matrice), krátké oligonukleotidy (tzv. primery), deoxyribonukleotidy (dNTP) a enzym, DNA polymeráza. Za vhodných poV tom hulanovom clanku je odkaz na clanok, kde typek nadava aj na Debian.dmínek je v takovéto směsi možné získat nový řetězec DNA, který je komplementární k původní DNA matrici.



Pro zobrazení další části se musíte přihlásit

doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.